如何保证发酵无菌系统

    一、优化设计发酵工艺及设备

    空气系统的处理设计

    据文献资料统计，城市中每立方米空气中含细菌数就多达103—104个，空气带菌导致发酵失败的几率高达20％左右。因此进入发酵系统前空气必须进行除菌处理，对于好气性发酵更应重视空气系统。空气系统设计应该注意的问题有以下几点：

    ①尽量改善采风口的环境，主要办法有：采风口选址在上风口，通风较好处；减少空气循环次数；提高采风口高度，目前已有企业升至35m以上；尽量加大排气口与采风口的距离，并采用滤袋、喷胶棉等介质对空气进行预过滤。

    ②选用螺杆式空压机，减少油分进入空气系统，提高空气压缩后的温度（可达120℃以上），并保持较长的时间，这对杀菌也有一定的效果。压缩空气经过二级冷却器后的温度必须低于露点，保证油水分离设备的分离效果。在实际应用中发现，南方空气潮湿地区冷却后的温度应降到16—18℃，北方干燥地区可高些。
 
    ③空气进入总过滤器及终端过滤器之前还需经过加热程序，目前使用较广泛的聚四氟乙烯膜过滤器具有除菌效率高（可达99．9999％）的优良性能，可过滤0.01μm的颗粒，能滤除全部细菌和噬菌体(细菌最小直径为0.3μm，噬菌体直径约0.02μm)。但其使用要求也较高，首先是相对湿度要控制在60％以下，主要方法就是提高压缩空气的温度至50℃以上，最高可达65℃左右。为了减少压缩空气加热温度的波动，可考虑安装蒸汽压力自控系统，以提高加热蒸汽压力的稳定性。其次过滤器的灭菌和使用也要十分注意。过滤器灭菌时，首先要将蒸汽的冷凝水排清。其次是要控制好过滤器的蒸汽压力和消毒时间（一般控制在0.1—0.12MPa，30min）；最后要彻底将滤芯吹干，否则容易造成滤芯过滤失效，所以过滤器的灭菌最好安排在发酵罐空消之前进行。在使用过滤器时，开启阀门要缓慢打开，不宜过急，以防止空气流速瞬间剧增而超过过滤器设计的空气流速要求，从而保证过滤器的除菌效果。

    ④加强过滤系统，保证过滤系统的有效性。目前已有企业在各发酵罐进气前加入3道过滤器，以保证空气的洁净度。

    设备的设计、制作和安装

    在设备设计、制作和安装过程中，设法减少设备死角是提高灭菌质量最为有效手段之一。由于设备制造商缺乏对发酵生产专业知识的了解，住往会出现许多人为原因造成设备死角的现象，以致设备在使用一段时间后出现许多问题。

    选材方面
    在罐体、阀门及罐内装置等选用不锈钢作为材质，可减少因出现锈斑而形成设备死角的问题；在发酵罐的设计和制作中可能出现以下问题：
    ①罐内安装加强板，一旦出现裂纹发酵液就会进入加强板与罐壁之间形成的死角，造成灭菌不彻底；

    ②焊接质量不好，如虚焊、明显的沙孔等都易造成死角；

    ③螺杆与螺孔不匹配等（搅拌叶和联轴器的固定）。上述三种现象，都容易积聚发酵培养基造成结垢，是发酵罐常见的设备死角。

    管路的安装和布置

    发酵管路（特别是物料输送的管路）阀门的安装、布置较之普通管道或阀门的要求更高，更细，既不能有渗漏，又不能有灭菌死角。所以需要注意以下几点：

    ①管道与管道进行焊接时，管口之间要吻合(如走熟料的管道，管口要45℃倒角)，有利于管内焊缝平整。

    ②尽可能减少弯头的使用数量，管道转弯时尽量使用制作弯管，以减少管道的焊口。

    ③管道与法兰焊接时，必须要内外两面焊(必要时内焊最好使用氩弧焊)，以保证焊口光滑，确保管道无死角。

    ④进料管、出料管、移种管等物料管道，安装布置时，必须要有2％的坡度；同时要避免出现U型或V型的管路布置，目的是要杜绝管道内出现积液现象，防止灭菌不彻底。

    ⑤阀门(物料管道)与法兰的密封垫圈最好使用聚四氟乙烯材料，且垫圈的口径要以法兰的口径为准(阀门的口径为公称尺寸，而法兰为标准尺寸)，否则垫圈会滞留杂物，而形成灭菌死角。

    ⑥安装阀门考克时，要安装在阀腔的末端或最低位，确保蒸汽在阀腔内的流通和冷凝水的排走畅顺。

    灭菌设备

    培养基的灭菌方法一般有实消和连消两种方法。实消方法分升温和保压两个时间段，均要求必须控制温度匀速上升，要经常对各进气管进行检查，确保每路管道蒸汽畅通；保压时发酵罐的罐压应达到0.1MPa以上，以确保发酵罐内空间灭菌的效果。

    目前应用最广泛的是低压蒸汽喷射器的连消工艺，该工艺既可以提高培养基的灭菌效果，又可以节约大量的蒸汽和冷却水。在实际生产中，可以根据不同发酵培养基的配比浓度，调整喷射器的灭菌温度和维持罐的保压时间。运用连消工艺主要注意下面几个问题：

    ①在连消进料初期，由于罐压较高，容易造成温度的波动，操作不当会出现低温料喷入维持罐的情况。如有这种情况，可以采取停进料，保压适当时间或将低温料排走等补救办法进行处理。

    ②在连消过程中因停电或输送泵出现故障，造成喷射器不能入料时，蒸汽会将维持罐的稳定液层打乱，造成物料的保压时间达不到灭菌工艺要求。此时应迅速关闭换热器的冷却水阀和维持罐的上出料阀，对罐内的培养基进行保压灭菌。

    ③为了预防换热片或管道、阀门出现渗漏，在进行物料降温时，要缓慢打开冷却水阀门，以免因降温速度过快产生负压，抽吸外界空气而造成杂菌污染。

    设备应急措施

    在发酵设备的管道上，为了实现工艺能力，减少管线布置，会将多种不同管线串连在一起，以达到管线的高效使用。在这种情况下，需要在管道上加装单向阀，以防止物料、水及蒸汽的倒流。同样，由于潜在的停电风险必然导致空气系统停止供气，气体倒流致使发酵失败。已经有企业采取如在发酵排气处加装单向阀等应急措施来为操作个人提供应急时间。

    二、发酵过程的染菌途径及原因分析

    发酵过程中常见的污染原因主要有空气带菌、培养基灭菌不彻底、设备死角、环境影响、人员操作等五个方面。可能污染的杂菌有芽孢杆菌、短杆菌、长杆菌、球菌、噬菌体等。在大生产中，要十分准确地找到污染源，难度极大。我们可以根据发酵污染杂菌的类型和时间，做出大概的判断，尽量避免防止污染工作的无用功。

    进行污染原因分析时可以遵循以下的思路：

    ①发酵污染范围较广，其污染源可主要从公用系统去找，如种子系统、空气系统、灭菌系统、补料系统、氨系统等。公用系统出现问题时均可能导致多个发酵罐同时污染。一个发酵罐污染的杂菌类型有多种时，这可能与种子罐接种时无菌操作失误或设备出现渗漏倒吸有关。同一个罐连续污染，则应重点检查人员操作和罐内死角。

    ②从污染杂菌类型分析，发酵污染粗大芽孢杆菌时，首先要考虑污染源可能来自培养基或设备灭菌不彻底。如果是发酵前期污染，则首要考虑种子培养基问题或移种管路灭菌不彻底；

    如果是发酵中后期污染，则首要考虑发酵培养基问题和发酵罐存在设备死角而灭菌不彻底；

    污染嗜碱性粗短芽孢杆菌时，就要对氨系统进行处理；

    污染较细长的杆菌时，就应考虑空气过滤器问题。

    ③影响发酵污染的因素众多，都与人的操作有关。发酵应该尽量避免防污染工作走样，必须时刻提醒员工严格按照SOP（标准作业程序）操作不走样。不管是什么原因造成污染，发酵全过程的操作人员必须及时进行分析、总结，发现问题，制订防范措施。

    培养基的配制和灭菌操作

    在发酵生产中，要杀灭99.999％嗜热性芽孢杆菌，理论上要求121℃、15min，但实际发酵生产要求灭菌温度和时间都明显比理论值要提高或延长。发酵培养基中，如果有较多固形物存在，会对灭菌质量造成很大的影响，如使用较普遍的玉米浆，其固形物是比较多的，使用时必须要经过30目的筛网过滤，以除去颗粒较大的料渣。相对于一些比较难溶的培养基(如酵母粉、蛋白胨等)，必须要提前2小时进行配料，确保培养基溶解充分，可增加过滤筛网把超过一定尺寸的颗粒去掉。需要指出的是，杂菌在搅拌的条件下会进行加速繁殖，加大培养基灭菌的难度，所以对发酵用原材料也需要有一定的控制。

    在生产中引人多通道电脑记录仪，记录培养基灭菌和发酵过程中的一些关键参数，对防污染工作分析也有很大的帮助。

    设备的清洗

    加强设备的清洗工作，是减少设备死角较为有效的措施之一，同时也能有效地防止有害微生物的孳生。不同的设备清洗周期有所不同，如种子罐、发酵罐等主要设备，待每批移种或放罐后必须用高压水枪进行清洗；

    而一些罐内结构简单的设备如配料罐、维持罐、换热器等可以根据罐内或板片的结垢情况，随时进行人工清洗或浸热碱处理。阀门的清洁检查同样相当重要，必须制订严格的制度来保证阀门的拆检。特别是经常接触物料的阀门，其阀芯与阀杆的连接处，最容易积垢，以致阀芯转动不灵活或锁死而造成死角或浸漏。

    做好环境卫生和发酵无菌验证

    除了以上几个因素外，发酵车间的环境也是一个不可忽视的环节。加强环境卫生和环境消毒，可以最大程度地降低杂菌对发酵污染的威胁。从杂菌检测中可以发现，发酵罐周围的环境是比较恶劣的，其杂菌的类型及数量比较多，如果在日常操作过程中某一个环节出错(如接种时或发酵过程中设备渗漏出现负压等)，都会给发酵成污染和经济损失。要消除环境污染对发酵的威胁需要采取如下采取具体措施：

    ①减少活菌体排放，发酵废液及洗罐水等处理后排放，减少噬菌和杂菌生长的机会；

    ②清除发酵周边环境的卫生死角，每天定期对发酵操作面进行清洗，确保无积水和沉积污物。根据杂菌(噬菌体)的检测结果(噬检1次／d，杂检1次／3d)，有针对性或不定期采用消毒水或漂白粉等对发酵环境进行消毒处理，以降低杂菌的密度。

    发酵过程的无菌验证是必不可少的，因为所有无菌系统及操作，最终是为了保证发酵生产的正常进行，而出现染菌的事件依然会发生。在发酵过程中，微生物检验人员应定期取样进行培养分析，监控可能的异常，提前预警可能的染菌情况，为生产提供必要的指导。随着生物工程技术在生产上的应用，发酵工程的应用不断增加，发酵过程无菌系统的保证不仅是提高了生产效率，降低了生产成本，对于产品食品安全也是一个有效的保证。